Page 221 - 《精细化工》2020年第9期

第 9 期 冯宪明，等: 中间苍白杆菌对含蜡原油除蜡降黏效果分析 ·1935·

菌种生长温度分别为：32、35、38、41 和 44 ℃。 菌体接种量为 2%，添加 2 mL 微量元素液，增设无
菌种生长 pH 范围：利用浓度 1 mol/L HCl 和 菌对照组。在恒温摇床中以 38 ℃、130 r/min 培养。
NaOH 调节培养基酸碱度，pH 分别为 5、6、7、8、9。 7 d 后，在对照组和实验组中分别添加正己烷，萃取
1.2.3 细胞疏水性测定 培养基中的剩余原油，反复萃取 3 次。利用无水硫
将菌液以体积分数 2%接种量添加至 100 mL 无 酸钠进行干燥，然后在旋转真空蒸发器中蒸干有机
机盐培养基，添加占培养基体积分数 2%液体石蜡为 相，得到剩余原油，以备后续分析。采用高精度电
唯一碳源，添加 1 mL 微量元素液，增设不加菌的实 子天平称量剩余油质量，反复称量直至质量一致。
验对照组，在恒温摇床中以 130 r/min、38 ℃恒温 并根据公式（3）计算生物降解率 [22] 。
培养。7 d 后，将菌液在离心机以 8000 r/min 高速离  ye 
生物降解率/%= 1    100 （3）
心 20 min，将菌体与上清液分离，以备后续分析。  x 
采用细菌对碳氢化合物的黏附来测定细胞疏水 式中：x 为实验组初始原油质量，g；y 为实验组剩
性（CSH） [19] 。用缓冲液洗涤菌体 2 次，将菌体悬浮 余原油质量，g；e 为对照组原油自然蒸发损耗量，g。
于 4 mL 缓冲液中，调整其 600 nm 下光密度值（OD） 1.4.2 原油蜡含量测定
为 0.5~0.7，记为 a。再将 4 mL 菌体悬浮液和等量煤油 分别取 1.4.1 节处理后的实验组和对照组原油
混合，高速涡旋 2 min，静置 2 h，同等条件下测定其 样品 6 mg 左右，制成试样。采用 DSC 分别测量实
光密度值，记为 b。根据公式（1）计算细胞疏水性 [20] 。 验组和对照组原油的蜡含量、析蜡温度等参数的变
CSH / %  (1 ba / ) 100 （1） 化情况。通过公式（4）计算蜡含量，公式（5）计

1.3 生物表面活性剂分析 算除蜡率。
1.3.1 表面张力  T c dQ
取 1.2.3 节得到的无菌体的上清液，在 25 ℃下 n /%   20  100 （4）
Q
采用旋转滴界面张力仪进行表面张力测定，同时在
同等条件下测量对照组的表面张力。 式中：n 为蜡含量，%；Tc 为油样偏离基线温度，
℃； Q 为蜡的平均结晶热量，取值 210 J/g；dQ 为
1.3.2 乳化活性
–20 ℃到温度 Tc 蜡释放出的热量，J/g。
乳化活性是利用正癸烷、正十四烷和液体石蜡
1
进行测定的。取对照组和实验组上清液 4 mL 分别与 除蜡率/%  n  n 2  100 （5）
4 mL 正癸烷、正十四烷和液体石蜡在 10 mL 离心管 n 1
式中：n 1 为对照组蜡含量，%；n 2 为实验组蜡含量，%。
中混合，高速涡旋 2 min，室温下静置 24 h，之后观
1.4.3 原油中蜡晶的形态分析
察乳化情况，测量乳化层高度。根据公式（2）计算
乳化活性（E24） [21] 。 分别取实验组（菌株处理后原油）和对照组的

E 24 / %  / h H  100 （2） 原油试样少许，采用偏光显微镜分别在 200 倍下观
式中：h 为乳化层高度，cm；H 为液面总高度，cm。 察其蜡晶形态变化情况。
1.4.4 含蜡原油流变性测定
1.3.3 排油活性
利用流变仪测定实验组和对照组油样的流变性
在直径为 15 cm 的洁净培养皿中加入 65 mL 纯
–1
变化情况，温度范围 30~60 ℃，剪切速率为 5 s ，
水。向水面中心滴入 1 mL 经油红染色的液体石蜡，
并绘制黏度-温度曲线。通过公式（6）计算降黏率。
在液体石蜡中心滴加 0.1 mL 上清液。观察油膜扩散
情况，并对排油圈的直径进行测量。 降黏率/%   1   2  100 （6）
1.3.4 表面活性剂的提取与鉴定  1
式中：  为对照组黏度，Pa·s； 为实验组黏度，Pa·s。
将上述离心得到的上清液用 6 mol/L HCl 调节 1 2
pH 为 2，置于 4 ℃下放置 12 h。在离心机中以
2 结果与讨论
9000 r/min 离心 20 min，然后将得到的沉淀物溶于
体积比为 2∶1 的氯仿与甲醇混合液中进行萃取。将 2.1 菌株特性
萃取后的沉淀物在旋转蒸发器中蒸干有机相，得到 2.1.1 菌株鉴定结果
生物表面活性剂。采用溴化钾压片法利用傅里叶红 经 16S rDNA 测定，获取菌株 F-1 的目的基因
–1
外光谱仪进行检测，波长范围 4000~400 cm 。 并与 GenBank 基因库进行 Blast 比对可知，该菌属
1.4 菌株对原油作用效果 于中间苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium），同
1.4.1 生物降解率测定 源性达到 99%以上，GenBank 序列号 MT221552 采
在 200 mL 无机盐培养基中加入 10 g 大庆原油， 用 MEGA7.0 软件临接法构建发育树，如图 1 所示。