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·710· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 36 卷

为测定以上 6 种酶活，纳他霉素发酵至 36 h 时 重法 [16] ；葡萄糖的测定采用 3,5-二硝基水杨酸法
加入 0.5 g/L 缬氨酸，继续发酵。取不同培养阶段的 （DNS） [17] ；pH 测定采用 pH 计。
S. natalensis HW-2 发酵液，于 4 ℃、10000 r/min 离
2 结果与讨论
心 5 min，收集菌丝体。采用超声波法破碎菌体 2 min
（超声 3 s，间隔 10 s），然后在 4 ℃、10000 r/min
2.1 支链氨基酸对纳他霉素产量的影响
离心 10 min，上清液用于酶活测定。每种酶活的测
当 S. natalensis HW-2 发酵至 24 h 时，添加不同
定按照相应试剂盒上的说明进行，HK、PFK、PK、
质量浓度的缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）和异亮氨
PC 和 PEPC 酶于 340 nm 波长下测定吸光度值；CS
酸（Ile），研究了 3 种氨基酸对纳他霉素生物合成的
酶于波长为 412 nm 下测定吸光度值。
影响，结果见图 1。
1.2.4 乙酰辅酶 A 浓度测定
纳他霉素发酵至 36 h 时加入 0.5 g/L 缬氨酸，
继续进行发酵。分别取培养 48、60、72 和 84 h 的
S. natalensis HW-2 发酵液，在 4 ℃、3000 r/min 离
心 10 min，弃上清留沉淀，保存于80 ℃待测。苹
果酸脱氢酶（MDH）可催化苹果酸和烟酰胺腺嘌呤
二核苷酸（NAD）生成草酰乙酸和烟酰胺腺嘌呤二
核苷酸磷酸（NADH），CS 催化乙酰辅酶 A 和草酰
乙酸产生柠檬酸和辅酶 A，利用苹果酸脱氢酶和 CS
的偶联反应，乙酰辅酶 A 含量和 NADH 的生成速率

成正比，于波长 340 nm 测定吸光值，其值的大小反
图 1 支链氨基酸浓度对纳他霉素生物合成的影响
映乙酰辅酶 A 含量的高低。具体操作方法按照试剂
Fig. 1 Effect of concentration of branched chain amino
盒上说明进行。 acids on the biosynthesis of natamycin
1.2.5 短链羧酸质量浓度测定
丙酮酸、乙酸、丙酸和 α-酮戊二酸是纳他霉素 由图 1 可以看出，缬氨酸对纳他霉素生物合成
的影响最大。与对照组(0.80 g/L)相比，0.25 g/L 异
合成单元（二碳和三碳）的主要来源；草酰乙酸是
生成丙二酰 CoA 和甲基丙二酰 CoA 的主要底物， 亮氨酸和 0.50 g/L 缬氨酸分别使纳他霉素的产量提
为纳他霉素合成提供前体。纳他霉素发酵至 36 h 时 高了 1.4 倍（1.12 g/L）和 1.8 倍（1.45 g/L），而亮
加入 0.5 g/L 缬氨酸，继续进行发酵，发酵过程中分 氨酸加入后没有明显效果。
别取培养 36、48、60、72 和 84 h 的 S. natalensis HW-2 2.2 缬氨酸添加时间的优化
发酵液，在 4 ℃、10000 r/min 离心 10 min，上清液 为研究缬氨酸添加时间对纳他霉素生物合成的
用 0.45 μm 滤膜过滤，滤液保存待测。以上羧酸含 影响，在不同时间添加质量浓度 0.50 g/L 缬氨酸，
量采用 HPLC 法测定，色谱条件：色谱柱 TSKgel 结果见图 2。

ODS-100V 柱（4.6 mm×250 mm×5 μm），柱温 35 ℃，
波长 210 nm，流动相为 V〔体积分数 0.1%H 3 PO 4 （pH=
2.3）〕∶V（甲醇）=98.5∶1.5，流速 1 mL/min。
1.2.6 纳他霉素产量测定
取 1 mL 发酵液和 9 mL甲醇混合，充分振荡 2 h，
10000 r/min 离心 10 min，采用 0.22 μm 微孔滤膜过
滤上清液，滤液 4 ℃保存待测。纳他霉素含量采用
HPLC 法测定，色谱条件：YMC-Pack ODS C 18 色谱柱
（250 mm×4.6 mm×5 μm），流动相为 V（甲醇）∶V

（水）= 75∶25，流速：0.8 mL/min，检测波长 λ=304
图 2 添加时间对纳他霉素产量的影响
nm。
Fig. 2 Effect of adding time on the biosynthesis of natamycin
1.2.7 细胞生物量、葡萄糖质量浓度和 pH 测定
测定缬氨酸对纳他霉素发酵过程的影响，发酵 从图 2 中可以看出，缬氨酸在发酵 36 h 时添加，
至 36 h 时加入 0.5 g/L 缬氨酸，每隔 24 h 取样测定 对纳他霉素合成的促进作用最强，纳他霉素的产量
发酵过程参数。细胞生物量（DCW）的测定采用干 为 1.57 g/L。结果表明，S. natalensis HW-2 在不同